Wentworth Miller est né en Grande-Bretagne en 1972 mais il a grandi dans le quartier new-yorkais de Brooklyn. Étudiant en littérature à Princeton, il fait partie du groupe a cappella de l'université, les Princeton Tigertones, ce qui lui permet de se produire sur de grandes scènes dans le monde entier. Diplômé en 1995, il s'installe à Los Angeles, où il travaille pour une petite société de production spécialisée dans les téléfilms. Tout en faisant de petits boulots derrière la caméra, il renoue alors avec les rêves d'acteur de son enfance et se présente à des castings.
En 1998, Wentworth fait ses début à l'écran dans un épisode de la deuxième saison de Buffy contre les vampires : il y interprète un des membres de l'équipe de natation du lycée de Sunnydale, transformé en homme-poisson lors d'une scène mémorable. Il enchaîne ensuite les apparitions à la télévision, notamment dans Popular et Urgences, avant d'obtenir son premier rôle important en 2002 dans la mini-série Dinotopia.
Sa carrière prend un tournant en 2003. Il apparaît aux côtés d'Anthony Hopkins et de Nicole Kidman dans La couleur du mensonge, puis avec Kate Beckinsale dans Underworld. On le remarque également dans deux clips de Mariah Carey, It's Like That and We Belong Together, où il vole presque la vedette à la diva. Wentworth trouve enfin la consécration en obtenant le premier rôle de Prison Break, une série carcérale à haute tension qui connaît un succès international et fait de lui un sex symbol.